近红外光谱技术在饲料蛋白含量测定中的应用,

核心提示:大豆中粗脂肪含量的测定 众所周知,大豆是营养丰富的食品,它含有丰富的粗蛋白和粗脂肪,粗蛋白含量高达40%而粗脂肪含量大概在20%左右

本文采用近红外光谱快速分析方法对豆粕中粗蛋白含量的测定结果的准确度和精密度进行了研究,建立了常规测定方法与近红外方法测定值的相关关系方程,对使用近红外快速检测法代替常规方法测定饲料中粗蛋白含量的可行性进行了评价。选取不同地区,不同工艺提取大豆油所余的豆粕样品320份,采用国家标准方法《GB 5009.5201 6食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》对样品中的粗蛋白含量进行检测,其中280份用近红外光谱仪收集光谱数据,用多元回归数据分析方法以及偏最小二乘回归数据模型对检验数据和光谱之间建立相关关系,制成近红外快速检测曲线,用40份样品验证预测值的可靠性。下面具体来了解一下详情:

核心提示:本文为大家介绍近红外光谱分析技术在饲料工业中的应用进展,详情见下文。

大豆中粗脂肪含量的测定

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近红外光谱分析技术(Nearinfraredreflectancespectroscopy,简称NIRS)是20世纪70年代兴起的一种新的成分分析技术。该技术首先由美国农业部的Norris开发,最早用于谷物中水分、蛋白质的测定。20世纪80年代中后期,随着计算机技术的发展和化学计量学研究的深入,加之近红外光谱仪器制造技术的日趋完善,促进了近红外光谱分析技术的极大发展。由于现代NIRS分析技术所独具的特点,NIRS已成为近年来发展最快的快速分析测试技术,被广泛应用于各个领域,特别是欧美及日本等发达国家,已将许多近红外光谱法作为标准方法。尽管NIRS技术在饲料工业上的应用起步较晚,但越来越被人们所重视。

众所周知,大豆是营养丰富的食品,它含有丰富的粗蛋白和粗脂肪,粗蛋白含量高达40%而粗脂肪含量大概在20%左右。是重要的食用油来源。但是随着科学技术的发展,人们越发不满足于大豆中20%的粗脂肪,人们纷纷开始寻找能够提高大豆中粗脂肪含量的方法。此时,粗脂肪含量的测定变得尤为重要。目前,测定大豆中粗脂肪的含量有很多中方法,如仪器法:用粗脂肪测定仪,它有多种型号,如:SZF-06B粗脂肪测定仪和SZF-06A粗脂肪测定仪等。当然还有更为普遍的,那就是基于索氏提取法的化学分析(GB290621982)。但是前两种我们都不能保持大豆的完整,此时一种新型的方法,诞生了,那就是近红外光谱技术,它异于前两种方法,是一种准确、快速、简便而且不破坏籽粒的检测方法。

日前,对动物饲料营养成分的研究已经由过去的粗放式转为集约模式,饲料的营养成分配比越来越受到动物营养学界的重视,科学的营养配比能够加强对畜牧产业的功能细分,提高饲料的利用率,优化畜牧产品的质量,更好的做到优质优价,提升畜牧产业附加值的同时,为市场提供更加优质的畜牧产品。凶此,对用于饲料加T的原材料营养成分检测的精度要求越来越高,检测的T作量不断加大,然而国标方法检测耗时较长,有时难以满足快速大量检测的要求。凶此本实验对近红外快速检测饲料粗蛋白进行了研究,探索对豆粕中粗蛋白含量快速准确检测方法的可行性。

1近红外光谱分析技术的基本原理及特点

近红外检测技术对大豆品种的要求,是尽可能利用样品数量多、覆盖范围广、样品类型丰富的样品,然后建立检测模型。当达到这一要求后,近红外检测技术测定大豆中粗脂肪的含量就相对比较精确,甚至高于化学分析的精确度。而且具有较好的稳定性和可靠性。当需要保存籽粒相对完整、QTL s/基因定位、导入系筛选和突变体筛选等的品质研究中,近红外技术已经得到了广泛的应用,甚至将替代化学分析检测。

1、实验样品的选择

1.1近红外光谱法的基本原理

当然,用仪器测量大豆总粗脂肪的含量也有较广泛的应用,因为它的快速简单。SZF-06粗脂肪测定仪是电热板加热,速度快,自动回收, 加热匀均自动回收,包含浸泡和抽提过程,缩短工作时间,外形更小巧美观。

按照不同产地,不同年份,不同取油方法,抽取具有代表性的样品280份用于建立标准曲线,40份用于验证曲线的可靠性。用于建立曲线的样品分别来自黑龙江省、河南省、河北省、新疆维吾尔族自治区、山东省等地。共计280份样品中,浸出法提炼的豆粕为213份,压榨法取油的豆粕为67份。用于验证试验的4O份样品中,浸ILIJ法提炼的豆粕为28份,压榨法取油的豆粕为12份。

近红外光谱的波长范围是780~2500nm,通常分为近红外短波区(780~1100nm,又称Herschel光谱区)和近红外长波区(1100~2500nm)。近红外光谱源于有机物中含氢基团,如OH、CH、NH、SH、PH等振动光谱的倍频及合频吸收,以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱,通过主成分分析、偏最小二乘法、人工神经网等化学计量学的手段,建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型,从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计算。

2、仪器设备

1.2近红外光谱法的特点

选用的仪器为瑞典波通公司生产的7200近红外光谱仪、电子天平、电炉、石棉网、微量滴定管、凯氏定氮仪等。

1.2.1近红外光谱分析的优点

3、方法原理

近红外光谱法的优点:①简单,无繁琐的前处理且不消耗样品;②快速;③光程的精确度要求不高;④所用光学材料便宜;⑤近红外短波区域的吸光系数小,穿透性高,可用透射模式直接分析固体样品;⑥适用于近红外的光导纤维易得,利用光纤可实现在线分析和遥测;⑦高效,可同时完成多个样品不同化学指标的检测;⑧环保,检测过程无污染;⑨仪器的构造比较简单,易于维护;⑩应用广泛,可不断拓展检测范围。

3.1 凯氏定氮法

1.2.2近红外光谱分析的缺点

采用国家标准方法《GB5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》对样品中的粗蛋白含量进行检测。豆粕中的蛋白质成分经过催化和加热,分解产生NH4 离子,NH离子在酸性条件下,与SO4用生成硫酸铵盐。接着在碱性条件下使得硫酸铵水解,加热生成游离的氨气,用硼酸吸收产生的氨气后,用硫酸标准溶液滴定。根据盐酸标准溶液的浓度以及消耗量计算含氮量,冉通过换算系数换算为粗蛋白含量。

近红外也有其固有的缺点:①由于测定的是倍频及合频吸收,灵敏度差,一般要求检测的含量?1%;②建模难度大,定标模型的适用范围、基础数据的准确性即选择计量学方法的合理性,都将直接影响最终的分析结果。

3.2近红外法

2近红外光谱仪的典型类型及进展

蛋白质分子振动的倍频振动状态会在相隔一个或几个能级间进行跃迁,或者存在两种分子振动状态产生合频,这两种能级同时产生跃迁的能量吸收,从而在近红外光谱区产生吸收。近红外光谱快速检测技术是一种间接的检测方法,也就是说在实验中通过对样品的吸收光谱和化学方法检测得到的质量数据进行关联,从而建立起预测模型,以此来预测样品的质量或者性质。近些近红外光谱分析技术更是进入了一个高速发展的新时代,已经成为一种快速高效的分析技术。

NIRS仪器一般由光源、分光系统、样品池、检测器和数据处理5部分构成。根据分光方式,NIRS仪器可分为:①滤光片型,分为固定滤光片和可调滤光片两种,其设计简单、成本低、光通量大、信号记录快、坚固耐用,但只能在单一波长下测定,灵活性差。②扫描型近红外光谱仪,分光原件可以是棱镜和光栅,该类仪器可进行全谱扫描、分辨率较高、仪器价格适中、便于维护;缺点是光栅的机械轴易磨损,抗振性较差,不适合在线分析。③傅里叶变换近红外光谱仪,是20世纪80年代以来的主导产品,其扫描速度快、波长精度高、分辨率好,短时间内可进行多次扫描,信噪比和测定灵敏度较高,可对样品中的微量成分进行分析,但干涉仪中有移动性部件,需较稳定的工作环境,定性和定量分析采用全谱校正技术。④固定光路多通道检测近红外光谱仪,是20世纪90年代新发展的一类NIRS仪器,采用全息光栅分光,加之检测器的通道数达1024或2048个,可得很好的分辨率,全谱校正,可进行定性和定量分析。仪器光路固定,波长精度高和重现性得到保证,而且无移动部件,其耐久性和可靠性都得到提高,适合现场分析和在线分析。⑤声光可调滤光器近红外光谱,被认为是20世纪90年代NIRS最突出的进展,其分光器件为声光可调滤光器,根据各向异性双折射晶体的声光衍射原理,采用具有较高的声光品质因素和较低的声衰减的双折射晶体制成分光器件,无机械移动部件,测量速度快、精度高、准确性好,可以长时间稳定的工作,且可以消除光路中各种材料的吸收、反射等干扰。

本实验应用近红外快速检测仪对样品进行30次/s的扫描,分别记录所选样品的蛋白质特征谱线,与实验测得的蛋白含量值一一对应,构建成标准预测模型。

3近红外光谱分析技术在饲料检测中的应用

4、模型建立

3.1常规成分的检测

4.1 记录近红外光谱特征谱线

NIRS在饲料检测中,最初多是用于饲草原料和谷物类原料中水分和蛋白质含量的检测,随后用于油料作物籽实的水分、蛋白质等的检测,都获得了满意的结果。最早由Norris[1]应用NIRS测定了饲草原料中的粗蛋白、水分和脂肪含量,其后Shenk等[2,3],Abrams等[4],Brown和Moore[5],Windham等[6],Givens等[7]均利用该技术分析鉴定了饲草原料的品质。随着NIRS技术的应用发展,Schaalje和Mundel[8]测定了大豆的氮含量;Fontaine等[9]完成了对鱼和鱼粉中油脂和蛋白质含量的检测;Garcia-CiudadA.等[10]估测了NIRS评价半干旱牧草地饲草的氮含量的相关性,建立了良好的定标模型;ParkR.S.等[11]利用NIRS对未干燥饲草进行了各种化学成分的预测,也取得了良好的效果。

将280份豆粕样品分别通过近红外光谱扫描,记录特征谱线,每个样品装样2次,重复测定2次,对于每份样品,近红外仪自动扫描60次,记录光谱特征曲线。

我国在20世纪90年初也开展了NIRS测定饲料各种成分定标软件的研制,先后完成了饲料和饲料原料中干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、灰分、氨基酸等指标的定标检测

4.2 测定粗蛋白含量的化学值

3.2氨基酸的检测

分别将用于曲线绘制的320份豆粕试样进行粉碎,使样品均能通过20日筛。将试样充分混匀,准确称量0.200g祥品于100mL凯式烧瓶中,加入0.5g硫酸铜、6g硫酸钾混合催化剂,冉加入20mL硫酸,轻轻摇振后瓶口加小漏斗后,将瓶口倾斜_5度,于石棉网上小心加热消化,直至泡沫完全消失,大火加热至消化液变为蓝绿色澄清透明液体后,继续加热半小时。停火冷却后缓慢加入蒸馏水20mL,再次冷却后移人100mL容量瓶,用蒸馏水定容,同时做空白实验。

氨基酸是组成蛋白质的基本单位,也是蛋白质的分解产物。缺少某种氨基酸,特别是必需氨基酸,或各种氨基酸配比不当,都会影响动物的正常生长发育。因此,氨基酸的测定在动物饲养、营养生理和蛋白质代谢、理想蛋白质模型的研究以及生产实践中都有重要意义。目前,我国科研工作者在这方面作了大量的实验研究。冯平[19]测定了小麦麸中赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸的定标,相关系数在0.84~0.97之间。魏瑞兰等[20]测定了花生饼粕中的8种氨基酸含量,取得了很好的效果。任继平等[21]研究表明,利用NIRS技术测定饲料原料氨基酸含量,具有快速、准确、成本低的特点。饲料厂可以利用NIRS技术对主要饲料原料氨基酸含量进行在线监测,调整配方和采购策略,降低生产成本,提高产品质量。

将10 mL浓度为20 g/L的硼酸溶液加入到接收瓶中,冉加入1~2滴甲基红乙醇溶液溴甲酚绿乙醇溶液混合标准指示剂,准确吸取2mL样液于反应器中(由于豆粕中蛋白质含量较高,因此加样量选择2mL),以10mL蒸馏水洗涤进样玻璃器皿后加入10 mL饱和氢氧化钠溶液,最后将进样器加水封严。开始蒸馏,10 min之后将接收瓶液面离开冷凝管,冉蒸馏1 min。用洗瓶使用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端后,取下蒸馏吸收瓶。尽快以硫酸标准溶液滴定,至浅红色到达滴定终点,记录消耗硫酸标准溶液的量。做空白实验,记录空白实验消耗的硫酸标准溶液的量。

3.3可消化氨基酸的测定

试样中蛋白含量一[10000×(试样消耗硫酸标准滴定液体积空白消耗硫酸标准滴定液体积)×硫酸标准滴定溶液浓度×0. 0140×蛋白质换算系数]/(试样质量×消化液体积)

NIRS法用于饲料中真可消化氨基酸的研究近几年国内主要是以中国农业大学丁丽敏等人的科研成果居多,他们进行了大量的可消化氨基酸的测定工作。1998年测定了鸡饲料中的真可消化氨基酸含量[22]。1999年进行了鱼粉氨基酸含量的测定,赖氨酸、蛋氨酸、肤氨酸、总的氨基酸的标准差分别为:0.375、0.304、0.074、2.041,相关系数分别为:0.939、0.664、0.962、0.975,取得了较满意结果[23]。同年,还测定过豆粕、玉米的真可消化氨基酸含量,豆粕中除与胱氨酸有关的几个方程外,其它氨基酸的定标经检验证明具有良好的预测性能,玉米真可消化氨基酸的定标性能不如豆粕好,目前还不能进行实际的应用,但大部分氨基酸定标方程的相关系数经F检验达到极显著水平,说明用NIRS预测玉米真可消化氨基酸是可行的[24]。2000年测定了棉籽粕、菜籽粕的真可利用氨基酸含量,结果表明棉籽粕除胱氨酸和色氨酸,菜籽粕除赖氨酸外,其它氨基酸的变异系数都在7%以下,经检验证明其定标具有良好的预测性能[25]。

所得蛋白质含量的单位是克每百克。

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4.3 形成预测模型

通过多元线性回归(Multivarate I』near Regression,mLR)、偏最小二乘法(PartialLeastSquare,PLS)等统计方法,建立特征谱线和化学值之间的关系,利用Q检验法排除个别差异较大的数据,建立预测模型。

5、验证试验

用刚刚建立的模型,依次将剩余的4O份样品进行扫描,与建立模型时一样,设定为每个样品装样2次,重复测定2次得到每个样品的预测数据。

6、数据分析

在对4IO份样品的预测数据以及化学值进行比较,计算得到模型的相关系数R为0. 963,标准差S.E.C.为0.04,变异系数C.V.为3.36。由预测值和化学值之间的差异可知,该预测模型预测结果的相关系数较好,变异系数较低,精确性较高,有一定的实用性和可靠性,但用于豆粕的粗蛋白测定还需要进一步验证其准确度和精密度。

7、结论

从本实验可以发现,利用近红外快速检测法检测豆粕中粗蛋白含量是可行的,用于建立曲线的样本越具代表性和全面性,所建立的模型就越可靠和实用。另外,近红外快速检测方法的准确性是建立在化学值可靠的基础上的,提高化学值检测的准确性也是提升预测模型准确性的重要方面。

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1.近红外光谱技术的发展自1800年Herschel第一次发现近红外光谱区至今已有200多年的历史。但由于物质在该光谱区的吸收信号弱,谱带重叠,解析复杂,且受当时的技术水平限制,很少有实际应用。20世纪80年代以后,由于计算机技术的发展和化学计量学的应用,高性能的计算机与准确、合理的计量学方法相结合,使光谱工作者能在较短的时间内完成大量的光谱数据的处理,近红外光谱在各领域中的应用研究陆续展开且得到了迅速发展。进入90年代,近红外光谱在工业领域中的应用全面展开。由于近红外光在常规光纤中良好的传输特性,使近红外光谱在在线分析领域得到很好应用,并取得良好的社会和经济效益,从此近红外光谱分析技术步入一个快速发展的新时期。2.近红外分析技术的基本原理在饲料行业内简称近红外光谱技术为近红外,即泛指这项检测技术,同时也指仪器设备本身。简单讲,近红外光谱仪由两部分组成。硬件和软件。近红外光谱仪器从分光系统可分为固定波长滤光片、 光栅色散、快速傅立叶变换、声光可调滤光器和阵列检测五种类型。饲料企业一般不涉及光谱扫描方式和检测器。饲料企业对于硬件设备除了按照使用手册操作和精心保养以外没有什么可以做的。全息光栅扫描具有较高的信噪比和分辨率比较符合饲料行业的要求。由于仪器中的可动部件在连续高强度的运行中存在磨损的可能。 从而影响光谱采集的可靠性,不太适合于在线分析。傅立叶变换近红外光谱仪是具有较高的分辨率和扫描速度。这类仪器的弱点同样是干涉仪中存在移动性部件。且需要较严格的工作环境。鉴于近红外光谱分析的基本原理主要是基于物质分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时光谱产生的变化。对近红外光有吸收。光谱测量方式有透射、反射和漫反射多种,主要记录的是饲料原料或产品中含氢基团X-H振动的倍频和合频吸收光谱。测定碳氢键、氢氧键、氢硫键、氯氢键和碳氧键对近红外光谱反射。由于不同基团或同一基团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别,因此光谱包含丰富的结构和组成信息。分子如果样品组成相同,则其光谱也相同,反之亦然。如果建立了光谱与待测参数之间的对应关系,那么,只要测得样品的光谱,通过定标模型,就能快速得到所需要的参数数据。

NIR分析中常用的化学计量学方法NIR以漫发射方式获得在近红外区的吸收光谱,通过多元线性回归、偏最小二乘回归、人工神经网络、小波变换等现代化学计量学手段建立物质光谱与待测成分含量间的线形或非线形模型,从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计算[5]3.近红外光谱分析的特点近红外光谱分析的优点:1)各种不同物态的样品不需处理可直接测量,且不消耗样品。2)谱带较弱,故测量光程较长,光程的精确度要求不高。3)所用光学材料便宜,一般石英或玻璃即可满足要求,并可用较强的辐射源,使信号的强度增加,提高信噪比。4)近红外光的散射效应较强,可做固体、半固体和液体的漫反射可散射分析。5)近红外短波区域由于吸光系数非常小,在固体样品中的穿透深度可达几厘米,因而可用透射模式直接分析固体样品。6)适用于近红外的光导纤维易得,利用光纤可实现在线分析或遥测,极适于生产过程控制和恶劣环境下的样品分析。7)分析速度快。8)除了含有氢原子的化学键外,其他基团的振动频率均不在近红外区域产生吸收,减少了干扰;有可能在其他基团组成的物质中检测极微量的含氢基团的物质,如谷物中微量水的分析。9)从一个光谱可获得样品的多方面信息。10)仪器的构造较简单,易于维护。由于近红外光谱的以上特点,与传统方法相比,在测量精度上有很大改善;与标准试验方法相比,NIR提供数据的速度快;其应用一般会使试验成本降低,提高分析效率,并取得可观的经济效益。近红外光谱分析的缺点:

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近红外分析也有其固有的缺点,主要表现在以下几点:1)由于测定的是倍频吸收,灵敏度差,特别在近红外短波区域,需较长的光程,对微量组分的分析仍较困难。2)红外光谱分析不是一个直接测定方法,而是将未知样品测得的光谱通过定标模型分析其组成或性质。因此,定标模型的适用范围、基础数据的准确性及选择计量学方法的合理性,都将直接影响最终的分析结果。图片 5

4.近红外光谱检测分析时的注意事项与讨论漫反射分析检测器所检测到的信号是分析光与样品间经多次反射、折射、衍射及吸收后返回样品表面的光。光与样品作用,在反射、折射及衍射等方面的差异都将影响反射系数,而这些差异又源于样品的粒径大小、分布和外观形态等方面的差异。另外,样品基体的变化对漫反射的强度也有很大的影响。其中,样品的粒径大小和均匀度对光漫反射强度影响很大。因此,要求待测样品的粒径大小、均匀度和基体与用于定标样品尽可能相同。4.1异常样品的分类异常样品可分为好和坏2类。好的异常样品加入定标后可增加该模型的分析能力,而坏的异常样品加入定标模型后降低模型准确度。甄别样品的标准有2个:1) H值好的异常样品0. 6≤H≤5. 0 ,通常坏的异常样品H > 5. 0。2) SEC ,通常好的异常样品加入定标模型后,SEC不会显著增加,而坏的异常样品加入定标模型后,SEC显著增加。4.2异常样品的处理NIR分析中发现异常样品后,要用经典方法对该样品进行分析,同时对该常样品类型进行确定。属于好的异常样品则保留,并加入到定标模型中,对定标模型进行升级;属于不好的则不应加入到定标模型中,以免破坏定标模型。4.3定标模型的选择定标模型的选择原则为定标样品的NIR光谱能代表被测定样品的NIR光谱,操作上是比较它们光谱间的H值。如果待测样品的H值 ≤0. 6 ,则可选用该定标模型;如果待测样品H值> 0. 6 ,则不能选用该定标模型;如果没有定标模型,则需要对现有模型进行升级。4.4模型的升级定标模型升级的目的是为了使该模型在NIR光谱上能适应于待测样品。操作上是选择25~45个当地样品,扫描其NIR光谱,并用经典方法测定水分、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸或蛋氨酸含量,然后将这些样品加入到定标样品中,用原有的定标方法进行计算,即获得升级的定标模型。4.5波长的准确性和重现性用加盖的聚苯乙烯来测定仪器的波长准确度和重现性,以陶瓷参比作为对照,测定聚苯乙烯皿中聚苯乙烯的3个吸收峰的位置,该3个吸收峰位置的漂移应小于0. 5 nm ,每个波长处漂移的标准差应小于0. 05 nm。4.6仪器外用检测样品的测定将1个饲料样品密封在样品槽中作为仪器外用的检测样品,测定样品中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪和水分含量,应无显著差异。4.7仪器噪声多次扫描仪器内部陶瓷参比,以多次扫描光谱吸光度残差的标准差来反映仪器的噪声。残差的标准差应控制在30 lg×10- 6以内。4.8异常样品的确定根据待测样品NIR光谱选用对应的定标模型,对样品进行扫描,然后进行待测样品NIR光谱与定标样品间的比较。如果待测样品H值 ≤0. 6 ,则仪器将直接给出样品的测定结果,如果待测样品H值> 0. 6 ,则说明该样品已超出了该定标模型的分析能力,对于该定标模型,该样品被称为异常样品。5.近红外光谱技术在饲料原料检测中的应用目前,应用NIRS已分析测定的植物组织包括叶、茎、全株和种子等成分指标已有几十种,包括水分、蛋白质、纤维、淀粉、糖分、脂肪、油分、灰分等, 其中牧草粗蛋白质、酸性洗涤纤维等的测定技术已被国际标准化委员会认可 。在新的饲料评定体系中,NIR也得到了应用。利用近红外光谱技术快速测定了玉米籽粒粉末康奈尔净碳水化合物组分,得出近红外光谱法能够很好地分析玉米籽粒粉末的干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、淀粉、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维组分的含量,可溶性蛋白质含量也可以预测,只是误差微高,但是预测酸性洗涤蛋白质和中性洗涤蛋白质成分的决定系数较低[6]。因此,有关这方面的研究还有待深入验证。由以上诸多研究结果可以看出,应用NIR技术快速检测法测定的饲料原料的常规成分值及钙、磷微量元素含量值与化学分析方法检测的结果十分接近或者是相关性较高,这也证明了NIR 技术在饲料原料评定中是一项快速、高效、准确、无污染的一项检测技术。

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