链球菌噬菌体被成功分离或控制罗非链球菌病,

发布时间:2015/7/23 9:10:01 来源:腾氏水产商务网 编辑:吴佩佩 图片 1我来说两句 图片 2 核心提示:2008年以来,整整7年时间,罗非鱼链球菌病一直困扰着罗非鱼养殖,可谓是“高温杀手”。直到现在,对于罗非鱼链球菌病也一直没有一个切实有效的治疗方案。 中国水产门户网报道

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摘要:在我国首次报导这一类噬菌体——罗非鱼链球菌噬菌体的研究,以无乳链球菌为宿主,由养殖罗非鱼的海水、河水以及罗非鱼分离到3株链球菌噬菌体。它们的共同特性为:双层营养琼脂平板的宿主菌苔上可形成无菌落生长的透明噬菌斑,噬菌斑形成须约12小时;形成噬菌斑的最适温度为30-39℃;可使浓厚的宿主菌营养肉汤悬液数小时内裂解澄清。4℃环境中保存360天可存活,但含量极低。

发布时间:2009/2/22 16:14:11 来源: 编辑:盛晓娜 图片 4我来说两句 图片 5 中国水产门户网报道噬菌蛭弧菌是Stolp和Petzold1962年[1]首次在德国的土壤中于一种植物假单胞菌上发现的一类细菌的寄生菌。它比通常的细菌要小,有似细菌病毒的作用,但不是病毒,具有细菌的特性。“寄生”和“裂解”宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。1982年[2]作者等在我国首次发现并及时报道了蛭弧菌的研究。近半个世纪来,国内外许多研究人员对蛭弧菌的分类学、细胞学、免疫学、生理学、生物化学、分子生物学、生态学以及蛭弧菌与宿主菌的相互作用等进行了系统的研究。至今已发表论文800余篇。
蛭弧菌的基本特性
蛭弧菌的基本特性可概括为如下几点:菌体狭小,宽约0.3-0.45μm;⑶端生鞭毛,很少多于1根,鞭毛带鞘,并着生于一端;⑷革兰染色呈阴性;⑸严格好气;⑹化能有机型;⑺含有DNA,并具有高度同源性,G C含量为42%-51%;⑻明显而稳定地分解蛋白质;⑼通过TCA循环进行代谢;⑽一般不能分解利用碳水化合物,而利用肽、氨基酸作为碳源和能源。不能利用环境提供的营养而生长,必须在宿主菌细胞内或其抽提物中才能生长、发育、繁殖,最后使宿主菌裂解;⑾具有双形性的发育史,有鞭毛交替,捕食性的类弧菌游动子,无鞭毛螺旋状营养阶段;⑿能够进入到宿主细菌内,并在那里发育、繁殖或具有某种遗传力。其中寄生性和溶菌性是蛭弧菌一个重要的标志。
蛭弧菌的理化特性
蛭弧菌生长要求的pH为6.0-8.5;温度为20-37℃,4℃,42℃时则不生长;在人工培养基上产生黄色色素、细胞色素a、b、c,还能产生各种酶类:如胞外酶,诱导损伤寄主细胞溶解和消化,蛋白酶,酯酶,促使细胞壁降解,并可利用寄主细胞质中的内含物;蛭弧菌不能利用碳水化合物,它是利用多肽及氨基酸作为能源和碳源的;蛭弧菌生长代谢过程中乙醛酸循环不明显,以不完全的三羧酸循环为主要代谢途径;蛭弧菌蛋白质含量极为丰富,可达干重的60-65%,DNA含量为5%,含有典型的嘌呤和嘧啶;蛭弧菌DNA合成的前体物质,全部来自宿主菌细胞,大约70%来源于宿主DNA,30%来源于RNA;蛭弧菌可直接利用单核苷酸作前体物质,合成其核酸;蛭弧菌在吸附、侵染、穿入等的整个生命周期中,需要多种酶类的参加;蛭弧菌的鞭毛,粗且带鞘,早期有人认为,鞭毛鞘是由细胞壁外膜组成,对尿素十分敏感;伯杰细菌鉴定手册已把蛭弧菌列入螺菌科位置不定的属——蛭弧菌属。
蛭弧菌的生态学及在自然界中的作用
蛭弧菌广泛存在于自然界,土壤、河水、近岸海水以及下水道的污水中都有它们的分布,可是干净的井水、矿泉水、自来水中都很难找到蛭弧菌的存在。一般污水中含量为105PFU/ml,土壤中含菌数为103-105PFU/g,淡水、海水中含菌量仅为50PFU/ml。据日本报道下水道污水中含蛭弧菌含量可高达每毫升数万个。然而它们在自然界究竟起什么作用呢?有人归纳为两个方面:⑴由于蛭弧菌具有寄生和溶菌能力,所以有可能利用这种拮抗作为同致病菌作为斗争的有力武器。有实验指出,将浮游球衣菌和水稻白叶枯病菌加入灌溉水中,便成为蛭弧菌的“食料”,结果致病菌大大减少了。另外,蛭弧菌还对大豆疫病假单胞菌有较强的侵染力。⑵由于这类菌广泛存于污水中,它对污水中常见的大肠菌具有寄生性,同时对污水中的弧菌属、志贺菌属、沙门菌属等细菌消除亦起重要作用,因此有人把蛭弧菌作为河流水域污染程度的一项最好指标。另一方面,它在水源自净方面无疑也起着十分重要的作用。苏联Pushchino污水处理厂用蛭弧菌净化污水的研究已取得成果。
近年来,许多实验室对蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然环境河水中的某些肠道致病菌方面,做了许多卓有成效的探索工作。目前已证实,蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属、球菌属等均有很高的裂解活性,特别是对弧菌属、沙门菌属和志贺菌属。进一步研究发现,蛭弧菌对自然河水中的副溶血弧菌,溶藻弧菌,海弧菌,河弧菌,鳗弧菌,拟态弧菌,嗜水气单胞菌,恶臭假单胞菌,屈挠杆菌,发光杆菌,伤寒沙门菌,大肠杆菌,等均有显着的净化作用。
本文就蛭弧菌的研究及生态制剂在水产养殖上的应用阐述如下。
1蛭弧菌的研究
1.1蛭弧菌生物学特性的研究
蛭弧菌的噬斑透明,无菌落形成。蛭弧菌的菌株不同,其噬菌斑的形态、大小也不同,大的直径可超过15mm,小的直径只约0.5mm,而且可随培养时间的延长而扩展。蛭弧菌培养于4℃环境中,大多数蛭弧菌可出现噬菌斑。
在液体中培养、增殖蛭弧菌,蛭弧菌能侵染、裂解宿主菌,3-5天使浓厚的宿主菌悬液裂解、澄清,蛭弧菌的数目增加。但是用这种方法增殖蛭弧菌,很难得到高效价的蛭弧菌培养物,即使在澄清的蛭弧菌培养液中反复的补充宿主菌,也不能达到高效价的增殖蛭弧菌的目的,原因尚不清楚,有待进一步研究。
蛭弧菌噬菌斑革兰染色高倍镜观察,可见典型的、多量的革兰阴性、小的弧或杆状细胞。蛭弧菌噬菌斑悬滴相差显微镜下可见到运动极其活泼,呈跳跃式积极追捕宿主的蛭弧菌细胞,在相差显微镜下,可以连续观察到蛭弧菌吸附、侵染、进入、增殖、生长、裂解宿主细胞的全过程。
电子显微镜负染透射镜观察,可见到弧状或杆状蛭弧菌细胞,细胞一端有一长的单鞭毛。还可见到蛭弧菌吸附在宿主菌细胞上的典型形态。超薄切片电镜观察,可见到蛭弧菌在细胞内生长、繁殖的结构。
pH对蛭弧菌生长及噬菌斑形成有明显的影响,虽然pH在3.0-9.8的自来水宿主菌双层琼脂平板上均可形成噬菌斑,而pH7.6最为适宜。
呼兰等从人粪便分离获得的蛭弧菌最适pH为7.0,pH9.0不能形成噬菌斑,其原因有待进一步检查。
蛭弧菌在4-37℃环境中形成噬菌斑,20-30℃时对大多数菌株的噬菌斑形成更为适宜。少数菌株37℃更为适宜。人粪便中分离的蛭弧菌也是以37℃最为适宜。在4℃冰箱中也能形成噬菌斑,但需较长时间。近来研究发现,极少数菌株可诱导至43℃中生长。
从自来水宿主双层琼脂平板中蛭弧菌形成噬菌斑数目来看,蛭弧菌生长繁殖的最为适宜温度为25℃。温度较高,如37℃时蛭弧菌数目反而逐渐减少,并失去活力。但于4℃冰箱中可继续生存,培养至第4天增殖数量为最高,此后反而减少。
蛭弧菌培养物不耐热,如蛭弧菌Bd81、Bd98,15-25℃以上时乃呈渐渐失活的现象,如以25℃2小时,蛭弧菌的活存数目为100%计,则15-20℃时呈较为稳定状态,存活数分别为94.9%-100%;30,35,40,45及50℃是时存活率依次为78.0%,62.7%,40.7%,30.5%和0%。
蛭弧菌在污水自净过程中参与作用的研究结果证明,蛭弧菌裂解作用可降低污水中异养性革兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量。这种裂解活性明显地受温度影响,因为温度可影响寄生菌与宿主菌之间相互作用的速度,在水温为26℃时寄生物/宿主的指数最大,而在19℃时最小。当污水在26℃时,沉淀池污水中含大肠杆菌为800CFU/ml,而在19℃时,含大肠杆菌为4000CFU/ml,污水中相互作用的微生物数量发生变化,这是典型的P/H的关系。这些研究结果证明,在污水自净过程中,蛭弧菌在26℃环境河水中可以有效地参与清除肠道微生物群,而在23.5℃时清除率低。
蛭弧菌于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上可比在未经处理的活的宿主菌双层琼脂平板上更迅速的形成噬菌斑,后者一般需40-48h才可出现噬菌斑。在加热及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h,形成噬菌斑的数目也大大增多。例如在100℃加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍,Bd98增加约72倍,在80℃加热致死的宿主菌中Bd81增加151倍,Bd98增加73。氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍,Bd98增加67倍。在这些宿主菌的琼脂平板中形成的噬菌斑也明显的小于在活菌平板上,形成噬菌斑的时间也较快,数量也有增加或没有增加。在抗生素处理失活的宿主菌双层琼脂平板上,形成噬菌斑的时间差别不大,噬斑的数量与在活菌宿主菌双层琼脂上也不增加。
实验结果证明,在加热致死的宿主菌上生长增殖的蛭弧菌,再接种在活的宿主菌琼脂平板上仍然恢复其生长特性和裂解的活力。
1.2蛭弧菌对不同科属细菌的宿主范围
从8株蛭弧菌在不同科属24株菌的琼脂平板上形成噬菌斑的能力试验中,发现蛭弧菌的宿主范围均较广,都可在自来水宿主双层平板中裂解较多不同科属的革兰阴性菌株及部分阳性菌株,于48h产生噬菌斑,从宿主范围看,不同的蛭弧菌株对宿主的选择并不相同。
司穉东等报道,蛭弧菌不但对人类病原菌有裂解作用,而且对许多植物病原菌也有较强的噬菌能力。如从上海近郊河水中分离的蛭弧菌对大豆疫病假单胞菌,白菜软腐菌和水稻白叶枯病黄单胞菌等均有较突出的裂解功能。
实验亦已证实,以10亿个菌的剂量对小鼠、豚鼠、家兔等不存在毒力和毒性作用。就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。有人指出,蛭弧菌外用有预防部分动物角膜炎的效果。呼兰、刘秉阳用福氏志贺菌感染豚鼠角结膜,并同时滴加蛭弧菌107PFU。结果发现15只感染的豚鼠眼中有6只未发病,得到保护,其保护率为40%。另外部分未获得保护的豚鼠眼是否由于福氏志贺菌感染用量较大或其他原因,有待进一步探索。
1.3蛭弧菌培养物保藏方法的研究
蛭弧菌于灭菌自来水中,4℃环境中保存,大部分蛭弧菌存活8个月以上,极少数菌株仅存活2个月。在自来水保存液中定时添加宿主菌,保持一定浓度,并不能使蛭弧菌不断增殖而延长时间。
蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中,于4℃环境中存活时间。发现91天蛭弧菌的存活菌株占100%,157天或188天占91.7%,240天占67.7%,31天占58.3%,372天占50.0%,411天占25.0%,548天占16.7%,600天时全部检不出蛭弧菌。
用脱脂牛奶作保护剂冷冻干燥于4℃冰箱保存蛭弧菌培养物,两年的存活率为100%,3年的存活率为81.8%。
链球菌噬菌体被成功分离或控制罗非链球菌病,噬菌蛭弧菌及其生态制剂的研究在水产养殖上的应用。以上3种方法保存的蛭弧菌次代培养物的生物学特性和寄生、裂解宿主菌的能力均不发生改变。
2蛭弧菌生态学的研究
2.1蛭弧菌在动物体内的分布
现已证明,蛭弧菌在马、牛、猪和鸭等动物肠道中都可检出,并经常随粪便排出体外到外环境中,其蛭弧菌的含量较低,一般在1-200PFU/ml。同一研究,在人体、小鼠、蚌和鱼体内的粪便中没有检出蛭弧菌,这可能与检索的样本数较少有关。
2.2蛭弧菌在自然水样325份,检出阳性254份。蛭弧菌在这些样品中的含量为1-5880PFU/ml或g。海泥的含量为2-246PFU/g;湖水中含量为2-268PFU/ml;河水中含量为1-5880PFU/ml。
蛭弧菌在自然界中分布非常广泛,一般说来,凡有细菌存在的地方都有它们的存在,特别是污水环境中它们的分布较为普通。但是蛭弧菌在环境中的分布及其变化与季节和河水污染程度有关。夏季较多,冬季、春季分别为夏季的16.6%和44.8%。
2.3蛭弧菌噬菌体
蛭弧菌可使一些细菌遭到毁灭性的溶解,可是蛭弧菌本身也受另一类生物的威胁,那就是蛭弧菌噬菌体。它们对寄生性和非寄生性的蛭弧菌都有裂解作用。然而,蛭弧菌噬菌体具有严格的专一性,并有其影响蛭弧菌裂解过程的作用。当蛭弧菌直接吸附宿主菌之前,或在完全侵入宿主周质之前,蛭弧菌噬菌体尾部首先吸附在蛭弧菌细胞上,然后,该噬菌体的核酸注入到蛭弧菌中,便完成它对宿主细菌的侵入,头部完全以空壳保留在细胞外,感染特异性噬菌体的蛭弧菌仍保持其原来的状态和大小,蛭弧菌噬菌体在蛭弧菌细胞中生长繁殖,而蛭弧菌本身仍处于宿主菌细胞中,结果导致蛭弧菌的宿主细胞破裂,此时,蛭弧菌噬菌体被释放到体外。
2.4蛭弧菌对水体中细菌净化作用的研究
蛭弧菌能寄生和裂解细菌,可否利用这一特殊的生物特性作为以菌制菌的手段?!
2.4.1蛭弧菌在水中对宿主菌的净化作用
蛭弧菌在灭菌湖水中,对宿主福氏志贺菌有显着的清除作用,如7天时福氏志贺菌被清除92.8%。
不同数量蛭弧菌于灭菌湖水中25℃时,对浓度为5.0×106-8.0×106CFU/ml弧菌均有净化作用,且随着蛭弧菌与ElTor霍乱弧菌投入比的增加,ElTor霍乱弧菌被清除的速率也增快,以5.0×106-8.0×106CFU/mlElTor霍乱弧菌清除到活菌计数为0时,投入比约为1:100000时需24天,约为1:10000时需18天。
蛭弧菌于灭菌湖水中25℃时,对大肠杆菌悬液亦有除菌效果。如第21天,加有蛭弧菌湖水中的大肠杆菌由原来的3.5×107CFU/ml,减少到11CFU/ml。
模拟自然条件的河水中蛭弧菌可使河水2天后变为澄清透明,6天后加有蛭弧菌和ElTor霍乱弧菌试验组的河水也变为澄清透明,但只加蛭弧菌的河水清澈。
蛭弧菌对模拟自然条件河水中革兰阴性菌的裂解率显着高于阳性菌的裂解率。因此蛭弧菌作用于河水中的细菌时,可以使河水中阴性菌迅速减少,减少的数目也多,阳性菌也有减少,但不及阴性菌,如11天及13天时,加蛭弧菌的试验组,河水中的阴性菌由原来的98%减少到64%及56%,而不加蛭弧菌对照组河水中的革兰阴性菌由原来的96%减少到94%及78%。
蛭弧菌可以净化水体中的细菌,这是无疑的。但蛭弧菌在净化细菌时,受多方面因素的影响,如温度、pH、生物等,其中蛭弧菌的量和蛭弧菌与宿主细菌的比例也是众多的影响因素之一。有人认为,蛭弧菌要发挥净化河水中细菌的功能,其在河水中的含量必须要达到102-103PFU/ml,否则,效果极差甚至达不到净化的目的。蛭弧菌与宿主菌的比例以1:1000较为合适。比例过高或过低蛭弧菌和宿主菌的消长很不明显。
2.4.2蛭弧菌在对自然河水净化过中河水中理化指标的变化
进一步检查河水的浊度单位,加蛭弧菌河水中的浊度单位也逐渐降低,如实验结束时,加有蛭弧菌河水的浊度由原来的40下降到10,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的浊度单位由原来的40下降到25。加蛭弧菌的河水生物耗氧量随着自然河水的逐渐净化而降低,如加蛭弧菌的试验组河水的生物耗氧量开始为7.6mg/L,到实验终末时减少到3.4mg/L,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的生物耗氧量由原来的7.5mg/L仅降低到5.7mg/L。在整个试验过程中,pH、氧化物、总硬度、钙、镁的含量都发生了一系列改变。推测这一系列理化指标的改变与蛭弧菌净化宿主菌的活动有密切关系,但这些变化是否为蛭弧菌净化河水的规律或客观指标,还有待进一步的研究。
3蛭弧菌微生态制剂的研究及在水产养殖上的应用
1989年秦生巨等[3]首次从太湖养殖珍珠的三角帆蚌中分离出9株嗜水气单细胞菌,随后进行了10株蛭弧菌对9株嗜水气单细胞菌裂解作用的研究。结果发现蛭弧菌对嗜水气单细胞菌的裂解率在80%以上。
1991年秦生巨、刑华等进行蛭弧菌微生态制剂对淡水鱼细菌病防治的研究。
1994年国家农业部正式批准“噬菌蛭弧菌微生态制剂”为二类新兽药。2005年农业部发布的国家兽药品种编号,噬菌蛭弧菌微生态制剂列为7027号。
1995年邵桂元,洪黎民以鲫鱼出血性腹水病病原菌点状产气单胞菌为宿主。从自然界分离获得6株噬菌蛭弧菌菌株。研究表明,这6株蛭弧菌能裂解多种鱼类病原菌。
1996年秦生巨等在上海奉贤利用蛭弧菌微生态制剂防治中国对虾的细菌病,并取得了满意的结果。
1996年黄琪琰、秦生巨用蛭弧菌微生态制剂防治甲鱼,河豚鱼细菌病的试验,结果证明,60天试验结束时,蛭弧菌微生态制剂可降低由人工感染引起的甲鱼、河豚鱼嗜水气单胞菌败血症的发病率85.5%,死亡率93.3%,提高增重率16%。
1997年杨淑专、黄庆辉报道,用宿主双层琼脂平板法,测定海洋蛭弧菌对25株对虾病原菌,绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌的寄生作用,结果表明蛭弧菌菌株不同寄生的范围不同,但所有供试寄主细菌都能被某些蛭弧菌寄生,形成清晰的噬斑。
1999年马志宏调查了北京地区25份水样,其中24份检出蛭弧菌,试验选用4株鱼类主要致病菌为宿主菌,检出的蛭弧菌对上述4种细菌的裂解范围有所不同,其中嗜水气单胞菌可被全部检出的蛭弧菌裂解,其他3株菌仅部分被裂解,依次为肠型点状气单胞菌,鳗弧菌。
2000年杨莉,王秀茹以不同浓度的蛭弧菌投放水族箱中,对鲤鱼用浸泡法进行人工感染嗜水气单胞菌试验。试验结果表明,蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解和净化作用,对水中氨氮有一定的降解作用,并且对鲤鱼感染嗜水气单胞菌所致暴发性出血病有明显的预防作用。
2001年中国海洋大学唐洛明[4]实验证明,蛭弧菌微生态制剂可以提高对虾育苗的成活率20%以上;可以推迟发病25天以上;增产增收明显;与抗生素相比,在水质改善方面有明显的作用,水质清新活爽,有绿色环保的功效。
2001年中国水产科学院黄海所徐健等[5]将球形红假单胞菌、噬菌蛭弧菌及粘红酵母予以不同搭配,得到4种微生态制剂,加入中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)幼体培育水体中,研究其对中国对虾幼体生长和非特异性免疫的影响。结果表明,使用这4种微生态制剂均极显着提高幼体变态率,存活率提高16.86%-34.22%,体长增加0.64-1.29mm;M1-P5期的体长平均增长率也高出17%-40%;酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力也显着高于对照组。其中添加蛭弧菌和球形红假单胞菌试验组的效果最好。
试验中球形红假单胞菌和蛭弧菌联合使用则比对照组高出34.22%,这体现了菌种配伍的优势。在养殖中还发现试验组的虾苗个体大、均匀、健壮,而对照组幼体个体大小不一,存在残食现象。
蛭弧菌和球形红假单胞菌联合使用在各方面都表现出协同作用,显示出其联合使用的优势。此组中球形红假单胞菌菌体含有60%以上的蛋白质,富含多种维生素,特别是VB12、叶酸和生物素,是酵母中含量的几千倍。此外,还有抗病毒的生长因子辅酶Q,含量是酵母的13倍,是幼体适口的饵料。蛭弧菌则对病原菌有很强地裂解作用,二者联合能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物质,这在营养、水质和防治病害上都有力保障了此组在各项指标上处于优势。
2004年张梁等[6]研究了蛭弧茵对养殖草鱼水体主要水化指标的影响。试验结果表明:蛭弧菌对养殖环境的主要水化指标具有明显的改善作用,试验组的平均COD、NH3-N、硫化物值显着低于对照组,试验组的DO显着高于对照组,而试验组与对照组的pH值差异不显着,同时提示在养殖草鱼水体中,全池泼洒10mL/m3的蛭弧菌,可有效改善水质。
2004年曾地刚等利用蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰细菌性败血病试验。结果证明,在试验水体中加入嗜水气单胞菌对斑点叉尾鮰进行感染,同时在水体中加入噬菌蛭弧菌,当水中的噬菌蛭弧菌浓度达到105cfu/ml以上时有预防斑点叉尾鮰败血病的效果。
2005年刘恒义、秦生巨等[7]利用复合蛭弧菌微生态制剂治疗大菱鲆由弧菌引起的重症出血病,结果证明,连续使用复合蛭弧菌微生态制剂3天,267尾严重出血的大菱鲆治愈率为98.7%,效果非常明显。
事实证明,近20年,尤其是本世纪以来,蛭弧菌及其微生态制剂在水产养殖上的应用和研究速度惊人,成果颇丰。
4未来10年蛭弧菌在水产养殖方面的研究方向及展望
自1979年我国开展对蛭弧菌的研究以来,蛭弧菌的研究进展很快,取得了不少成果。至今已公开发表论文200余篇。但蛭弧菌及其制剂在水生动物上的应用还需要进一步的研究;甚至是很艰苦的探索工作。近年来我国已有许多实验室相继开展了这项工作。
利用蛭弧菌净化养殖水体,控制或减少水生动物疾病的发生和流行,运用生物之间的相互拮抗作用,开展水生动物相关疾病的生物防治已受到水产工作者的重视,并进行了广泛的研究。利用微生态制剂防治动物的相关疾病,解决动物源性食品中药物残留对人类的危害,近年来已成为人们关注的热点。
蛭弧菌在水生动物疾病防治中的作用,已引起众多研究者的兴趣和关注,也被公众逐步认知,并在日益接受。实验研究已证明,蛭弧菌对许多种属的细菌有清除作用。今后的研究方向,主要是如何将蛭弧菌推广应用于自然环境水体净化,以改善养殖水源,保护环境,控制或减少水生动物疾病的发生,解决动物源性食品中药物残留,造福于人类。但这项技术人们必须从以下几方面进一步去研究。
4.1蛭弧菌在自然环境中与其它生物的关系
蛭弧菌在自然环境中与其它生物的关系,特别对养殖水体中致病菌自净作用是个极其重要而具有意义的生物学和生态学问题,值得很好的探究。
4.2蛭弧菌生态制剂生产用菌株
研究已证实,蛭弧菌的宿主范围广泛,它在养殖水体中对致病菌发生裂解和溶解的同时,如何不侵袭有益菌?!海水和淡水含的物质不一样,养殖的水生动物品种不一样,主流菌群也不一样。蛭弧菌生态制剂生产用菌株如何选择?
4.3蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌
蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌“三位一体”的寄生体系是独特的。这一现象值得注意,对这一现象进一步的研究可能是有意义的。
4.4噬藻蛭弧菌[8]
近年来在蛭弧菌分类学的研究中发现,除上面3种蛭弧菌以外的一些新种,如噬藻蛭弧菌等,它们可使藻类的弧状体裂解而逐渐死亡。这一发现对水生动物疾病的防治无疑是有益的,人们应深入研究。
4.5生产用蛭弧菌株的筛选
高产量蛭弧菌株的选择以及生物制剂的生产,实验用蛭弧菌显然不宜作为生物制剂生产用菌株;而且蛭弧菌的增殖需大量的宿主菌的营养来源,所以蛭弧菌生物制剂的生产工艺不同于一般生物制剂的生产菌种,国际通用的法则,生产菌种必须经过严格的鉴定、分类,确保其生物学原型。凡是生物物种经过反复人工传代都有发生突变的可能。早在1975年Starr就发现蛭弧菌的突变株,目前所知,野生菌株几乎都在宿主细胞内生存的。但对其衍生菌株的研究,特别是对其突变株的研究用于描述蛭弧菌代谢机制是具有重要的意义和指导实践价值的。
突变后的蛭弧菌有可能回复致病性,这种致病性往往是超强的,这种疾病往往让人类猝不及防。“非典”、“禽流感”不能不引起人们的反思。目前国内蛭弧菌生态制剂的生产、销售的盲从和无序,人们应慎重从事,不能对社会不负责。
4.6蛭弧菌生物制剂的剂型及使用途经
目前蛭弧菌生态制剂局限于液体制剂,液体制剂在实际使用上可能是方便的,但运输和保存是不利的。蛭弧菌生态制剂冻干粉剂的技术国内外均有成功的报道,如何去利用这项技术,关键是超滤浓缩。如蛭弧菌发酵液经过超滤浓缩、冻干,利用蛭弧菌生态制剂冻干粉剂制成半悬浮状的微型胶囊,在水生动物疾病的防治中更为重要。现在蛭弧菌液体制剂使用途经有泼洒、拌料内服、浸泡,是否有更为有效地途经应该探讨。
4.7分子遗传学的研究
4.7.1遗传工程
目前,遗传工程已成为生物科学中的一门最引人瞩目的学科,1978年美国分子生物学家借助于人工合成的限制性内切酶,从大肠杆菌的染色体上剪去一段DNA,然后把能合成人胰岛素的基因,以质体为运载工具移接到大肠杆菌的染色上,细菌在恢复生长后,便具有合成人工胰岛素的能力。蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌系统是引人注意的独特的“三位一体”的寄生体系,并可利用宿主菌DNA合成蛭弧菌子代,这已经被研究证明。如能从某一致病菌的染色体上切去一段DNA,移接一段蛭弧菌基因到致病菌的染色上去,使致病菌丧失致病力而仍保持抗原特性,然后再用该菌株生产菌苗或用于其他生物学的研究,可能是有意义的探索。
4.7.2溶菌物质
蛭弧菌对宿主细胞的裂解特性,长时间以来,一直被人们关注。对蛭弧菌的裂解机制也进行了大量的研究工作。1978年Thomashow等提出的“蛭弧菌穿入、稳定、裂解”模型较有代表性。参与这一过程的主要酶包括:聚糖酶,蛋白酶,N-脱酰基酶、酰基转移酶,Braun去脂蛋白酶,裂解经修饰的肽糖酶,脂酶,溶菌酶等。
聚糖酶及脂蛋白酶只是在蛭弧菌“穿入”时有活性,而蛋白酶在蛭弧菌的大部分生活期间有活性,但活力不断下降。这三种酶在蛭弧菌“钻孔”中起了作用。N-脱酰基酶、酰基转移酶的作用是维持蛭弧菌小体的稳定,能使之抗渗透压,不被破坏。去Braun脂蛋白酶主要是通过修饰底物细胞壁,使聚糖酶作用消失,而完成这一功能。当蛭弧菌在周质中生长时成熟后,蛭弧菌合成一种新的酶,其功能是完全裂解修饰的肽聚糖,其作用位点于肽聚糖中不可缺少的氨基糖连接键。从而释放子代蛭弧菌。
有人发现,用蛋白质合成抑制剂,如链霉素、嘌呤素及氯霉素等,可抑制蛭弧菌的穿入。据此认为,蛭弧菌穿入时宿主细胞壁破坏还有诱导酶的产生,诱导物存在于宿主细胞内。Fackeell等报到,蛭弧菌穿入宿主细胞时,至少有溶菌酶、胞壁酸酶及酯酶等,Bd6-5-S还可释放两种多肽酶,分子分量为40kDa及100kDa。Michael等研究证明,当蛭弧菌穿入宿主时,聚糖酶及多肽酶的活性很高,短时间内溶解宿主菌10%-15%的肽聚糖。聚糖酶溶解肽聚糖中的氨基糖,多肽酶水解肽聚糖中的二氨基庚二酸、大约30%二氨基庚二酸残基被水解。穿入过程结束时,这两种酶的活性明显降低或消失。与此同时在脂多糖中25%的葡萄糖胺被一种分子量小于2kDa的酶水解,该酶在穿入结束时,也不起任何作用。为此,许多人认为,酶是蛭弧菌穿入宿主细胞壁的主要因子。
5结束语
进一步研究蛭弧菌在生物防治中的作用是专家们近年来一致呼吁的。蛭弧菌对宿主特异性不强,工、农、医微生物都有被“寄生”和“裂解”的可能。因此,我们研究蛭弧菌,应扩大其研究范围,不应过多的重复研究。推测用蛭弧菌对工、农、医的生物防治以及环境保护,其前景是诱人的,将会产生较大的社会效益和经济效益。

2008年以来,整整7年时间,罗非鱼链球菌病一直困扰着罗非鱼养殖,可谓是“高温杀手”。直到现在,对于罗非鱼链球菌病也一直没有一个切实有效的治疗方案。

噬菌体【1】是一类细菌特异性的病毒,它有典型的病毒形态和结构。噬菌体对宿主有高度的特异性。噬菌体的作用方式,是以尾鞘吸附到宿主细胞特定的受点上,向菌体内注射RNA,并在菌体内复制子代,最终溶解宿主的方式,释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主内生长繁殖。

7月22日早上6点,《当代水产》记者从南京巨豹生物工程有限公司秦生巨老师处获悉喜讯:秦老师已经成功分离出链球菌噬菌体!

罗非鱼,俗称:非洲鲫鱼,非鲫、越南鱼、南洋鲫等。原指以莫桑比克为模式产地的口孵非鲫属鱼类物种:莫桑比克口孵非鲫(学名:Oreochromismossambicus),现为慈鲷科非鲫属及口孵非鲫属等属数种鱼类的共同俗称;英文里统称为Tilapia。现在它是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类,且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。通常生活于淡水中,也能生活于不同盐份含量的咸水中,也可以存活于湖,河,池塘的浅水中。它有很强的适应能力,在面积狭小之水域中亦能繁殖,甚至在水稻田里能够生长,且对溶氧较少之水有极强之适应性。绝大部分罗非鱼是杂食性,常吃水中植物和碎物。

这就意味着,链球菌病“高温杀手”的“魔咒”即将被打破。以下是本刊记者第一时间连线秦生巨老师,关于这一重大发现的详细采访。

链球菌是化脓性球菌的另一类常见的细菌,广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部,大多数不致病。医学上重要的链球菌主要有化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌等。引起人类的疾病主要有:化脓性炎症、毒素性疾病和超敏反应性疾病等。

《当代水产》:我们都知道您一直在做蛭弧菌、噬菌体这方面的研究,但对链球菌噬菌体专项研究较少听闻,为什么会您会想到去做这方面的工作?这个分离实验做了多长时间才成功的?

罗非鱼链球菌病是2009年发生在广东、广西、海南三省的一种鱼类疾病。网箱和池塘养殖的罗非鱼均有此病的发生,主要危害亲鱼和100克以上的幼鱼和成鱼;流行高发期为5-9月份;流行水温为25℃-37℃,在水温32℃以上易发-传染性强,发病率达20%-30%,发病鱼的死亡率可达80%以上。

秦生巨:虽然很多一线朋友反映目前水产养殖链球菌病很厉害,非常棘手,没有有效的防控措施。中科院珠江水产研究业内人士建议我是否从噬菌体生物防控方面做些工作。但我因为工作比较忙,一直没有时间去做这项工作。这次做链球菌噬菌体的分离,也是受一个契机的影响。

近年来国内许多同行都在探索罗非鱼链球菌病的防治方法,但国内外尚未发现用噬菌体防治罗非鱼链球菌病的报导。2015年我们在海南省做了罗非鱼养殖水体及罗非鱼体内链球菌噬菌体的分离检测。本文是对此次分离、纯化的链球菌噬菌体的初步研究结果的报导。

去年年初在海南开会,很多朋友跟我说,受到链球菌的影响,现在罗非鱼的养殖很令人恼火,好多塘都不敢养,用抗生素还好,如果不用抗生素,70%-80%都会死的,很厉害。但用了抗生素,药物就超标。所以他们也希望我能在这方面能够有什么方法解决这个问题。

材料与方法

我也实地走访了一些养殖户和养鱼的塘口,看出这个问题确实比较严重,所以我就下决心花点时间试一下链球菌噬菌体的分离工作。就这样才做出来的这个决定,前后花了1年多的时间。

培养基:胨肉膏液:蛋白胨10g,牛肉膏5g,NaCl5g,加蒸馏水到1000ml,调整pH到7.4。固体培养基:上述胨肉膏液加1.2%琼脂粉。半固体培养基:上述胨肉膏液加0.7%琼脂粉。软琼脂培养基:上述胨肉膏液加0.3%琼脂粉。0.85%生理盐水:NaCl8.5g,加蒸馏水到1000ml,调整pH到7.4。

要进行链球菌噬菌体分离工作,必须要有经过分离鉴定确认是水产品致病的菌种,在这方面得到了水科院珠江所的支持。

宿主菌株:用于检查、分离、培养链球菌噬菌体及其检查其宿主范围的链球菌株为本公司及中国水产科学研究院珠江水产研究所保存者。

另外,要分离获得这一类噬菌体,只有在链球菌病害高发区的水体中才容易获得。所以要从广东、广西、海南等地的去采集样本,去做分离实验。到今天为止已经检测100多份水样,花了1年多时间,终于分离获得了链球菌噬菌体。噬菌体暂定名:HN48/SS130920,HN48/SS130920噬菌体在平板中形成的噬菌斑如下图。用于分离的宿主菌无乳链球菌SS130920菌种由水科院珠江所提供。

检测样本:用于检测的水体和罗非鱼样本来自海南省海口市郊区桂林洋和文昌市大致坡。

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噬菌体噬菌斑的检测、计数:幼稚宿主菌悬液的制备:将保存获得的链球菌在胨肉膏固体培养基平板上划线分离,于37℃培养18-24小时,取典型的菌落图片,革兰氏染色镜检,可见典型的链球菌形态。取典型的菌落接种到胨肉膏液中,于37℃培养4-6小时备用。双层琼脂法:参见文献【2】

图为透亮空斑点为无乳链球菌HN/SS130920噬菌体噬菌斑

链球菌噬菌体的检出、分离、纯化与培养:采集的新鲜水样450ml,加10倍浓缩的胨肉膏液50ml,加幼稚宿主菌悬液2ml于37℃培养过夜。采集的罗非鱼样品取其鱼的内脏10-15g加到500ml的胨肉膏液中,同时加2ml幼稚宿主菌悬液,于37℃培养过夜。取培养过夜的样品上清液10ml,12000prm取上清液,于56℃水浴培养1小时,取上清液0.5ml以链球菌幼稚菌悬液0.2ml为宿主,用双层琼脂平板法检查噬菌斑的形成。有透明的噬菌斑的形成即可判定有噬菌体的检出为阳性,未见有透明的噬菌斑的形成即可判定噬菌体的检出为阴性。分离、纯化、培养参见文献【2】。

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图为无乳链球菌SS130920对照无噬菌体噬菌形成

链球菌噬菌体的保存:将分离获得的噬菌体HN48/SS130920制成上清液,用以下不同的方法和条件保存。(1)胨肉膏液:于100ml胨肉膏液中加噬菌体上清液2ml;(2)软琼脂:于10ml胨肉膏软琼脂中加噬菌体上清液0.5ml;(3)半固体琼脂:于10ml胨肉膏半固体琼脂中加噬菌体上清液0.5ml;(4)于自来水液中加含量大约为105/pfu噬菌体。以上4种方法都同时平行做两组,一组加链球菌幼稚菌液,使其浓度大约为106/cfu。另一组不加链球菌幼稚菌液。4种方法每组做3管。然后加有链球菌幼稚菌液和不加链球菌幼稚菌液的保藏物,分别放置于4℃、37℃及室温(南京市的2015年9月到2016年8月)保存,并检查存活时间。

《当代水产》:这次成功分离出来的链球菌噬菌体是哪种链球菌?可以应对哪些水产品的链球菌病?

结果

秦生巨:在医学上重要的链球菌主要有化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌等。目前引起水生动物链球菌病的主要是无乳链球菌为主。无乳链球菌在鱼的、虾的、海豚等动物体内都有分离到,其中在罗非鱼身上的反应是很强的。所以我们分离获得HN48/SS130920无乳链球菌噬菌体对罗非鱼链球菌病的控制提供重要的科学依据和实际应用价值。

一、噬菌体的检出、分离结果及菌株的检查

《当代水产》:一个典型的噬菌体的侵染细菌的过程,可以分为三个阶段:感染阶段、增殖阶段和成熟阶段。从实验结果上看,链球菌噬菌体感染链球菌细胞需要多长时间?

2015年7-9月及2016年9-10月于海南省文昌市和海口市6处采集海、淡水样79份,罗非鱼样品3份,共计82份样品。其中检出在链球菌宿主上能形成噬菌斑的5份(3.79%),其中淡水检查3份,海水2份,罗非鱼样品没有检出噬菌斑。有5份阳性结果经噬菌斑纯化得到3株(HN48/SS130920、HN58/SS130920、HN74/SS130920、)无杂菌生长的噬菌体株,对其进一步检查。其结果为:

秦生巨:链球菌噬菌体侵染链球菌的细胞的时间很短,只需要几分钟就可以完成,环境合适30分钟就可以复制一次,比蛭弧菌感染宿主的过程要短得多,蛭弧菌一个感染过程是2-4个小时。所以一旦能够应用到生产实际中,效果将会很显着。

(1)在胨肉膏双层琼脂培养基平板上,于37℃培养12-18小时形成透明的噬菌斑,噬菌斑的直径1-3mm(见图版照片)。

《当代水产》:噬菌体有利有弊,在吞噬链球菌细胞的同时,是否会对水体中其他有益菌细胞造成影响?

(2)可使浓厚的宿主菌胨肉膏悬液(20亿/ml)4-6小时后裂解透明。
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秦生巨:不会,绝对不会!噬菌体具有高度的特异性,是一对一的,一不可能对二。它是以特定的宿主菌细胞为靶标,只要侵染成功,它的作用是100%的。所以,链球菌噬菌体只会对链球菌起作用,不会对其他的菌细胞起作用。

二、温度对噬菌斑形成的影响

《当代水产》:目前是处于实验阶段,预计投入生产需要多长时间?产品大概会在什么时间面市?在实际应用中如何使用?

检查了不同温度对3株噬菌体于胨肉膏双层琼脂培养基平板上形成噬菌斑活力的影响,25-40℃16小时均可形成噬菌斑。但从已形成噬菌斑活力来看35℃更为合适20℃及以下、45℃及以上未见噬菌斑的形成。结果见表1。

秦生巨:小范围的试用试验会马上进行,但是真正要投入使用,还需要一些时间,至少要等到明年以后。

表1不同温度对链球菌噬菌体形成噬菌斑活力的影响
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表内“ ”为噬菌斑检出阳性,“-”为噬菌斑检出阴性。

因为噬菌体是分离获得了,但它的相关生物学特性还要进行进一步研究。如果今年这些工作都能够完成,明年生产成产品,那就很不错了。

三、于不同的链球菌株上形成噬菌斑能力的测定

至于产品的使用方式,可以拌料,也可以泼洒到水体中。对于已经在体内感染的鱼,拌料可以从肠道中进行充分感染,这些产品从苗种就可以应用。

检查了3株噬菌体于胨肉膏双层琼脂培养基平板上对不同来源的链球菌形成噬菌斑的能力(宿主范围)。每平板接种噬菌体上清液0.5ml,链球菌宿主菌幼稚培养液0.2ml,37℃培养16小时观察结果。结果见表2。

《当代水产》:我们都知道,现在链球菌病并没有根治的方法,只能尽可能减少损失。链球菌噬菌体的成功分离,对于罗非鱼链球菌病,是否能够起到根本性的根治作用?

表23株噬菌体于不同来源的链球菌株上形成噬菌斑能力的测定
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表内“ ”为噬菌斑检出阳性,“-”为噬菌斑检出阴性。

秦生巨:说到根治,不能这样下结论,应该说是完全有可能控制罗非鱼链球菌病的发生和流行。因为要根治,涉及到一个使用方法的问题。还需要配合相关的水体条件,在所有方法、条件都满足,那就可以100%解决问题,也就是所谓的可以根治。

四、保存方法及存活时间

比如说,水温,在一定条件下,水温的高低影响到链球菌噬菌体的效果。因为我在做生长培育的时候,在研究实验中发现,链球菌噬菌体最适合的生长温度是35-37℃,这时它的生长繁殖速度是最快的,效果是最佳的。外环境温度再高,可能超过40℃甚至更高,但是水温一般很难超过30℃,不会超过35℃。

检查了噬菌体HN48/SS130920在胨肉膏液、软琼脂、半固体琼脂、自来水中的存活时间;同时检查了加有宿主链球菌幼稚菌液和不加宿主链球菌幼稚菌液对其保存的影响;也观察了在4℃、37℃及室温(南京市的2015年9月到2016年8月)链球菌噬菌体存活时间。结果见表3。

所以我现在担心的不是水温过高的问题,担心的是水温过低,如果水温低于20℃,它的效果会很差。

表3不同保存方法对噬菌体HN48/SS130920存活时间的影响
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表内“ ”为噬菌斑检出阳性,“-”为噬菌斑检出阴性。

讨论

根据噬菌体株的特性这是一类以链球菌为宿主的链球菌噬菌体。据此次调查,养殖罗非鱼的海、淡水体都可分离到此类噬菌体的存在,但含量有限。

噬菌体分布极广,凡是有细菌的场所,就可能有相应噬菌体的存在。在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中,常含有噬菌体。链球菌噬菌体在污染的水源中也不难找到其宿主,尤其是水生物的养殖水源中。25-40℃都有裂解活力。在加有宿主菌的胨肉膏液中4℃环境中保存一年以上仍可检出。因此推测在自然环境水体中将可繁衍生存。其存在对链球菌,尤其是罗非鱼链球菌病的病原菌在自然界的生物控制中所起的作用值得进一步探讨。

参考文献
【1】秦生巨:当代水产,2:15,2014
【2】AdamsMH:bacteriophages,IntersciencePubIncNewYork1959.

END

1、来源:腾氏水产商务网-当代水产杂志社
2、作者:南京巨豹生物工程有限公司秦生巨戚太海沧州旺发生物技术研究所有限公司张连水中国水产科学研究院珠江水产研究所罗霞
3、腾氏水产商务网微信号:tsfish

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